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Etudes fonctionnelles et structurales des intégrases rétrovirales

Unité de Recherche

UMR 7104 - Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire (IGBMC)
1 rue Laurent Fries 67404 ILLKIRCH

Équipe

Nom : Expression de l'information génétique

Responsable : MORAS Dino - moras@igbmc.fr

Téléphone du responsable : 0388653220

Site web : Accéder au site

Composition de l'équipe :
- Chercheurs : 4
- ITA : 3
- Doctorants : 2
- Post-Docs : 3
- Autres : 1

Publications majeures de l'équipe relatives au sujet au cours des 3 dernières années (le cas échéant, 3 publications récentes du DT) :
1) Le Rouzic E, Bonnard D, Chasset S, Bruneau JM, Chevreuil F, Le Strat F, Nguyen J, Beauvoir R, Amadori C Brias J, Vomscheid S, Eiler S, Levy N, Delelis O, Deprez E, Saïb A, Zamborlini A, Emiliani S, Ruff M, Ledoussal B, Moreau F, Benarous R. Dual inhibition of HIV-1 replication by integrase-LEDGF allosteric inhibitors is predominant at the post-integration stage. Retrovirology. 2013 Nov 21;10(1):144.
2) Maillot, B., Lévy, N., Eiler, S., Crucifix, C. , Granger, F., Richert, L., Didier, P., Godet, J., Pradeau-Aubreton, K., Emiliani, S., Nazabal, A., Lesbats, P., Parissi, V., Mely, Y., Moras, D., Schultz, P. and Ruff, M., (2013), Structural and functional role of INI1 and LEDGF in the HIV-1 preintegration complex, PLoS ONE 8(4): e60734.
3) Cribier A, Segeral E, Delelis O, Parissi V, Simon A, Ruff M, Benarous R, Emiliani S. (2011). Mutations affecting interaction of integrase with TNPO3 do not prevent HIV-1 cDNA nuclear import. Retrovirology, 104, doi: 10.1186/1742-4690-8-104

Concernant la thèse

Directeur de Thèse : RUFF Marc - ruff@igbmc.fr

Téléphone : 0388653349

Co-encadrant : LEVY Nicolas

Co-tutelle : non

Co-Directeur : non

Concernant le sujet proposé :

Titre : Etudes fonctionnelles et structurales des intégrases rétrovirales

Projet : Une des étapes essentielle dans les étapes précoces de l'infection par les retrovirus comme HIV est l'intégration du génome viral dans les chromosomes des cellules hôtes. L'intégrase est une protéine présente dans les différentes étapes de l'infection rétrovirale impliquant le complexe de pré-intégration (PIC). Elle participe ainsi à la transcription inverse, à la migration du PIC le long des microtubules, au transfert vers le noyau, au ciblage de la chromatine et à l'intégration. L'intégrase est une protéine désordonnée présentant une importante flexibilité inter-domaine et fait partie de la famille des protéines intrinsèquement désordonnées. Cette flexibilité permet ses multiples fonctions biologiques et explique sa capacité à interagir avec des partenaires multiples. Dans cette étude structurale et fonctionnelle, nous allons comparer in vitro et in cellulo, plusieurs intégrases rétrovirales seules ou en complexe avec de l'ADN et/ou des cofacteurs cellulaires et viraux afin de déterminer les relations structure-fonction pour les différents rôles de l'intégrase.
A chaque fonction de l'intégrase est associée une conformation structurale propre induite par les molécules partenaires : protéines, ARN, ADN, ainsi que par des modifications post-traductionnelles comme l'acétylation, la méthylation et la phosphorylation. Nous criblerons les différents complexes pour définir leurs conditions de stabilité et de solubilité optimales qui sont nécessaires pour les études structurales et fonctionnelles.
L'objectif principal du projet proposé est l'analyse structurale et fonctionnelle de ces complexes. Les techniques utilisées vont du clonage à l'étude structurale en passant par la production de protéine ainsi que la caractérisation physico-chimique et fonctionnelle.
Les résultats déjà obtenus dans le laboratoire portent sur l'intégrase (IN) de HIV-1 en complexe avec la protéine cellulaire LEDGF (Michel et al., EMBO J, Feb 2009). Une structure par cryo-microscopie électronique de ce complexe a été obtenue à 14 Ǻ de résolution et a permis de proposer un modèle pour l'intégration de l'ADN viral dans l'ADN de la cellule hôte. Un deuxième complexe de l'intégrase en interaction avec deux protéines cellulaires (LEDGF et INI1) et de l'ADN a été résolu en cryo-microscopie électronique Maillot et al., PloSone, 2013). La première étape sera la mise au point de la production à grande échelle des complexes à partir de protéines recombinantes. La production des complexes stables est faite dans trois organismes, E. Coli, cellules d'insectes et cellules de mammifères. La purification se fait par chromatographie d'affinité suivit par une filtration sur gel, et suivant les cas par une autre étape de purification (interaction hydrophobe, échange d'ion).
De manière transversale nous utilisons des techniques de caractérisation structurale et physicochimique (ES-MS, Trypsin digestion /MALDI, High Mass MALDI-TOF, RMN, microscopie électronique, ultra centrifugation analytique…). L'étude fonctionnelle des complexes se fait en analysant leurs capacités à fixer l'ADN viral par des techniques d'anisotropie et de corrélation de fluorescence.
Les études structurales se font avec diverses techniques : microcopie électronique pour la caractérisation et la détermination de structures à moyenne résolution, radiocristallographie pour la détermination des structures à haute résolution (lignes de lumière synchrotron et robot pour la validation des cristaux et l'acquisition automatique des données de diffraction), et diffusion des RX aux petits angles (SAXS) pour la caractérisation et les études en solution.

Compétences souhaitées : Biologie moléculaire et structurale, physico-chimie, biophysique, biochimie.

Expertises qui seront acquises au cours de la formation : Production et purification de complexes multi-protéiques. Utilisation de systèmes d'expression procaryotes et eucaryotes. Caractérisation de complexes par des méthodes biochimiques et biophysiques. Détermination de structure par microscopie électronique et cristallographie, étude des relations structure/fonction.