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Evolution dirigée d'ARN en microgouttelettes

Unité de Recherche

UPR 9002 - Architecture et réactivité de l'ARN (IBMC)
15, rue Rene Descartes 67084 - Strasbourg Cedex

Équipe

Nom : Réseaux de reconnaissances biomoléculaires

Responsable : WESTHOF Eric - e.westhof@ibmc-cnrs.unistra.fr

Téléphone du responsable : 0388417046

Site web : Accéder au site

Composition de l'équipe :
- Chercheurs : 7
- ITA : 2
- Doctorants : 1
- Post-Docs : 1
- Autres : 0

Publications majeures de l'équipe relatives au sujet au cours des 3 dernières années (le cas échéant, 3 publications récentes du DT) :
1) Fallah-Araghi, A., Baret, J.C., Ryckelynck, M., and Griffiths, A.D. (2012). A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution. Lab on a chip 12, 882-891.
2) Najah, M., Griffiths, A.D., and Ryckelynck, M. (2012). Teaching single-cell digital analysis using droplet-based microfluidics. Analytical chemistry 84, 1202-1209.
3) Cattenoz, P.B., Taft, R.J., Westhof, E., and Mattick, J.S. (2013). Transcriptome-wide identification of A > I RNA editing sites by inosine specific cleavage. RNA 19, 257-270.

Concernant la thèse

Directeur de Thèse : WESTHOF Eric - e.westhof@ibmc-cnrs.unistra.fr

Téléphone : 0388417046

Co-encadrant : RYCKELYNCK Michael

Co-tutelle : non

Co-Directeur : non

Concernant le sujet proposé :

Titre : Evolution dirigée d'ARN en microgouttelettes

Projet : Ce projet de thèse consistera en la production d'aptamères par évolution dirigée en microgouttelettes créées et manipulées à l'aide de la technologie microfluidique. Dans un premier temps, les travaux initiés dans l'équipe sur l'amélioration des propriétés de fluorescence de l'ARN Spinach, un aptamère reconnaissant spécifiquement un cofacteur (le DFHBI) et formant un complexe fluorescent seront poursuivis. Une nouvelle approche de recombinaison in vitro sera utilisée pour générer un large espace de séquences et de motifs structuraux, avec pour objectif de multiplier le nombre de sites de reconnaissance du cofacteur avec une augmentation de taille minime. Après séquençage des produits de sélection, les variants les plus représentés seront produits et purifiés, leurs propriétés de fluorescence caractérisées et leur structure secondaire établie par une approche mixte sondage en solution/prédictions informatiques.
Les performances de cette nouvelle forme de Spinach (iSpinach) seront ensuite évaluées in vivo en systèmes bactériens. La molécule sera tout d'abord exprimée dans E. coli, seule, insérer dans une structure stabilisatrice ou en fusion avec un ARN messager et la fluorescence de la bactérie suivie au cours du temps à l'aide de notre plateforme d'imagerie. Une fois le système et sa sensibilité validés, le motif sera transplanté dans des bactéries pathogènes (e.g. S. aureus, L. monocytogenes…) en fusion avec des ARN messagers ou des ARN régulateurs afin de suivre l'expression de ces cibles au cours du temps. Cette partie de projet se fera au travers de collaborations avec des équipes spécialisées dans l'étude de ces bactéries, notamment celle de Pascale Romby.
Le dernier volet de ce projet consistera en l'utilisation de Spinach (voire d'iSpinach) comme sonde fluorescente pour l'évolution in vitro de nouveaux riboswitchs régulateurs de la transcription. Pour ce faire, des banques de variants établies sur la base d'un riboswitch existant seront réalisées en fusion avec Spinach. La réalisation de cycles de sélections positives et négatives en microgouttelettes (en présence et en absence du métabolite que le nouveau riboswitch devra reconnaître) permettra d'isoler de nouveaux régulateurs de l'expression des gènes qui trouveront des applications dans le domaine de la biologie synthétique.

Compétences souhaitées : Bases de la chimie organique, biologie moléculaire, biochimie,

Expertises qui seront acquises au cours de la formation : Microfluidique, imagerie, biologie structurale de l'ARN, biologie digitale