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Microscopie de molécules uniques avec des nanoparticules à conversion ascendante

Unité de Recherche

UMR 7213 - Laboratoire de biophotonique et pharmacologie (LBP)
Faculté de Pharmacie, 74 route du Rhin, BP 60024, 67401 ILLKIRCH-GRAFFENSTADEN

Équipe

Nom : Biophotonique des interactions moléculaires et cellulaires

Responsable : MéLY Yves - yves.mely@unistra.fr

Téléphone du responsable : 0368854263

Site web : Accéder au site

Composition de l'équipe :
- Chercheurs : 18
- ITA : 2
- Doctorants : 19
- Post-Docs : 2
- Autres : 4

Publications majeures de l'équipe relatives au sujet au cours des 3 dernières années (le cas échéant, 3 publications récentes du DT) :
1) A. REISCH, P. DIDIER, L. RICHERT, S. ONCUL, Y. ARNTZ, Y. MELY, & A. KLYMCHENKO. Collective fluorescence switching of counterion-assembled dyes in polymer nanoparticles. Nat. Comm. 2014, 5, 4089.
2) V. KILIN, H. ANTON, N. ANTON, E. STEED, J. VERMOT, T.F. VANDAMME, Y. MELY, & A.S. KLYMCHENKO. Counterion-enhanced cyanine dye loading into lipid nano-droplets for single particle tracking in zebrafish. Biomaterials, 35, 4950-7.
3) N. KEMPF, V. POSTUPALENKO, S. BORA, P. DIDIER, Y. ARNTZ, H. de ROCQUIGNY, & Y. MELY. The HIV-1 nucleocapsid protein recruits negatively charged lipids to ensure its optimal binding to lipid membranes. J Virol., 2015, 89, 1756-67.

Concernant la thèse

Directeur de Thèse : MELY Yves - yves.mely@unistra.fr

Téléphone : 0368854263

Co-encadrant : PRZYBILLA Frédéric

Co-tutelle : non

Co-Directeur : non

Concernant le sujet proposé :

Titre : Microscopie de molécules uniques avec des nanoparticules à conversion ascendante

Projet : Les nanoparticules à conversion ascendante (upconverting nanoparticles, UCNPs) à base de nanocristaux dopés aux lanthanides possèdent une propriété unique par rapport à tous les autres marqueurs luminescents. En effet, elles réémettent des photons dans la gamme du visible après excitation par de la lumière proche infrarouge. L'émission anti-Stokes est une propriété spécifique de ces nanostructures qui permet de les détecter avec un bruit de fond quasiment nul, y compris dans des échantillons biologiques. Les autres caractéristiques qui rendent les UCNPs très attractives sont leur grande photostabilité et l'absence de clignotement. Par ailleurs, les études d'interaction protéine-acide nucléique à l'échelle de la molécule unique permettent de révéler des détails invisibles dans les mesures d'ensemble tels que des états transitoires et des distributions de populations inhomogènes. L'utilisation de marqueurs fluorescents conventionnels complique ces études du fait d'un bruit de fond important, générant un rapport signal sur bruit médiocre. Au cours de ce projet de thèse, nous proposons de développer en collaboration avec H.Gorris et T. Hirsch (U. Regensburg) une méthode à l'échelle de la molécule unique, basée sur le FRET (Förster Resonant Energy Transfer) et tirant parti des propriétés uniques des UCNPs. Pour cela, nous utiliserons en tant que donneurs de FRET, des UCNPs de moins de 10 nm synthétisés par nos partenaires et des fluorophores organiques en tant qu'accepteurs. Ces nanoparticules seront enrobées par une fine couche de polymère afin de pouvoir les rendre solubles dans l'eau et les décorer avec des fluorophores. Une étude comparative de différents fluorophores accepteurs et polymères permettra de sélectionner le système de FRET le plus efficace. En parallèle, avec nos partenaires allemands, la composition des UCNPs sera optimisée pour la détection de particules uniques. Dans un second temps, nous attacherons des acides nucléiques à la surface des UCNPs. L'ajout de séquences complémentaires marquées à différentes positions par des accepteurs induira la formation de structures double brin rigides dont nous exploiterons la structure régulière pour caractériser la dépendance de l'efficacité de FRET avec la distance UCNP-fluorophore accepteur. Ensuite, nous utiliserons un système déjà été étudié en molécule unique : l'interaction entre la reverse transcriptase de VIH-1 et des séquences amorces/matrices du génome de VIH-1 pour valider notre approche. La comparaison des résultats obtenus avec ces séquences sous leur forme ADN et ARN sera importante puisqu'il a été démontré que l'enzyme adopte des orientations opposées sur ces deux types de séquences, de sorte que différentes efficacités de FRET sont attendues. Les données obtenues avec cette nouvelle méthode seront comparées avec celles de la littérature afin de vérifier que le couple donneur-accepteur et en particulier l'UCNP ne perturbe pas l'interaction. Du fait de l'amélioration du rapport signal sur bruit apportée par les UCNPs, une étude plus fine de l'interaction RT/substrat devrait être possible. Par ailleurs, la photostabilité des UCNPs permettra de suivre ces interactions sur des durées plus longues, ce qui devrait autoriser le suivi d'évènements d'association/dissociation multiples et la mise en évidence de cinétiques lentes. Finalement, nous exploiterons les capacités de multiplexage des UCNPs. En effet leur spectre d'émission est constitué de bandes d'émission étroites bien séparées spectralement (>100nm), de sorte que la même nanoparticule peut être utilisée avec deux accepteurs différents. Cette caractéristique unique sera utilisée pour étudier l'interaction entre trois partenaires. Nous intègrerons la protéine de nucléocapside (NCp7) de VIH-1 au système RT/oligonucléotide afin de déterminer l'influence de NCp7 sur les cinétiques d'association/dissociation ainsi que l'orientation de l'enzyme sur son substrat.

Compétences souhaitées : Compétences à l'interface chimie/physique/biologie. Bonnes connaissances en photophysique et microscopie.

Expertises qui seront acquises au cours de la formation : Sujet fortement interdisciplinaire. Des expertises seront acquises dans des techniques de microscopie de pointe, ainsi que dans l'enrobage et l'utilisation de nanoparticules à des fins biologiques.