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Application des nouvelles approches de cristallisation et de cristallographie sérielle sous rayonnement X-FEL à l'étude structurale de complexes enzyme : ARNt

Unité de Recherche

UPR 9002 - Architecture et réactivité de l'ARN (IBMC)
15, rue Rene Descartes 67084 - Strasbourg Cedex

Équipe

Nom : Traduction mitochondriale et pathologies

Responsable : CATHERINE FLORENTZ ET MARIE SISSLER - c.florentz@ibmc-cnrs.unistra.fr, m.sissler@ibmc-cnrs.unistra.fr

Téléphone du responsable :

Site web : Accéder au site

Composition de l'équipe :
- Chercheurs : 5
- ITA : 1
- Doctorants : 2
- Post-Docs : 2
- Autres : 0

Publications majeures de l'équipe relatives au sujet au cours des 3 dernières années (le cas échéant, 3 publications récentes du DT) :
1) Thermodynamic properties distinguish human mitochondrial aspartyl-tRNA synthetase from bacterial homolog with same 3D architecture. A. Neuenfeldt, B. Lorber, E. Ennifar, A. Gaudry, C. Sauter, C. Florentz & M. Sissler. Nucleic Acids Res. (2013), 41, 2698-2708.
2) Structural insights into protein-only RNase P complexed with tRNA. A. Gobert, P. Pinker, O. Fuchsbauer, B. Gutmann, R. Boutin, P. Roblin, C. Sauter & P. Giegé. Nature communications (2013), 4, 1353.
3)

Concernant la thèse

Directeur de Thèse : SAUTER Claude - c.sauter@unistra.fr

Téléphone : 03 88 41 71 02

Co-encadrant : non

Co-tutelle : non

Co-Directeur : non

Concernant le sujet proposé :

Titre : Application des nouvelles approches de cristallisation et de cristallographie sérielle sous rayonnement X-FEL à l'étude structurale de complexes enzyme : ARNt

Projet : Ce projet doctoral s'intègre aux études fonctionnelles et structurales de complexes enzymes / acides nucléiques mitochondriaux menées par l'équipe « Traduction mitochondriale et pathologies » (UPR 9002, CNRS, IBMC). Parmi ces enzymes interagissant avec les ARN de transfert, l'aspartyl-tRNA synthétase (AspRS), une enzyme mitochondriale humaine dont les mutants ponctuels sont associés à une leukoencéphalopathie. Leur caractérisation par cristallographie des rayons X permettrait de comparer leurs structures 3D à celle de l'enzyme sauvage afin de mieux cerner l'origine de leur dysfonctionnement [1]. Il s'agit également d'une nouvelle famille d'enzymes de maturation des ARNt découverte en 2008, les RNases P protéiques de la famille PRORP [2]. Dans les deux cas, des premiers cristaux ont été obtenus mais, comme très souvent dans ce type d'études, ils nécessitent une optimisation pour être exploitables en diffraction des rayons X.
L'optimisation de la qualité des cristaux biologiques, puis de leur conditionnement pour une analyse sous rayonnement X synchrotron, peut être longue et fastidieuse. Aussi, forte d'une longue expérience en cristallogenèse biologique, l'équipe d'accueil s'est récemment tournée vers une technologie innovante et une approche plus rationnelle de préparation des cristaux. Grâce au soutien du LabEx MitoCross, elle s'est dotée en 2014 d'un tout nouvel instrument, le Xtal Controller 900 (Xtal-Concepts GmbH, Hambourg) ; il permet de manipuler une goutte de cristallisation de quelques microlitres en jouant sur les concentrations de biomolécule et d'agent cristallisant (grâce à des microinjecteurs), tout en suivant l'évolution du système en direct par diffusion de la lumière (détection d'événements d'agrégation ou de nucléation, de la formation de nanocristaux) et vidéo-microscopie (suivi de la croissance cristalline), le tout dans une enceinte thermostatée et à humidité contrôlée. Pour la première fois, la recherche et l'optimisation de conditions de cristallisation sont réalisables de manière rationnelle et contrôlée, avec un suivi en temps réel des expériences. Ce projet de thèse contribuera au perfectionnement de cette technologie et à l'exploration des possibilités qu'elle offre en terme d'études de cristallogenèse et de biologie structurale, en collaboration avec le laboratoire du Professeur Christian Betzel (Université de Hambourg) qui a conçu cet instrument et la société Xtal-Concepts. Une application directe sera la production des nanocristaux requis pour l'analyse par pulses ultra rapides et intenses de rayons X fournis par les lasers à électrons libres (XFEL). La source XFEL européenne (http://www.xfel.eu/en/) est en construction à Hambourg à proximité du laboratoire partenaire allemand. Depuis la démonstration de sa faisabilité en 2011, la cristallographie sérielle femtoseconde (SFC) basée sur l'analyse séquentielle de nanocristaux sous XFEL a révélé tout son potentiel pour des échantillons difficiles à obtenir sous forme de cristaux micrométriques. La perspective de l'ouverture de la source européenne en 2017 est un moteur très important de ce projet qui peut se décliner en trois objectifs principaux :

- Exploiter et développer la technologie du Xtal Controller dans les travaux en cours dans l'équipe sur la cristallisation des enzymes mitochondriales eucaryotes décrites plus haut, seules et en complexe avec leurs substrats ARN.

- Mettre au point des protocoles de production des nanocristaux requis pour l'analyse par pulses ultra rapides et intenses de rayons X fournis par les lasers à électrons libres (XFEL).

- Utiliser ces deux technologies de rupture pour obtenir une description structurale et dynamique détaillée de fonctionnement des systèmes étudiés, de leurs dysfonctionnement et des événements de reconnaissances moléculaires ou de catalyse associés.

Compétences souhaitées : Le(la) candidat(e) aura au minimum une expérience en purification des biomolécules, en cristallisation ou en biologie structurale (préférentiellement en biocristallographie). Les compétences complémentaires seront acquises en cours de thèse au sein de l'équipe d'accueil.

Expertises qui seront acquises au cours de la formation : Ce projet de thèse s'adresse à un candidat attiré par l'interdisciplinarité et lui permettra d'acquérir une solide formation aux frontières de la biologie, de la chimie et la physique, incluant des aspects allant de la biochimie préparative (purification et cristallisation des biomolécules) à la biologie structurale (caractérisation biophysique en solution, analyse bioinformatique et détermination de structures cristallographiques).